Gästtestare Dean Madden testar säkrare alternativ än etidiumbromid för färgning av DNA i elektroforesgeler.

De färger som testats är:

Metylenblått (Methylene blue)
Nilblåsulfat (Nile blue sulphate)
Sigma BlueView (TM)
Azur A (Azure A)
CarolinaBLU (TM)
Kristallviolett (Crystal violet)
Brilliant kresylblått (Brilliant cresyl

blue)

Etidium bromid, en potent mutagen
I forskningslaboratorier används vanligen etidiumbromid och liknande fluoriscerande ämnen som Acridin Orange till att färga geler innehållande DNA. Tyvärr är etidiumbromid och dess nedbrytningsprodukter potenta mutagener och carcinogener och bör därför inte användas i skolor.

Dessa färger består vanligen av platta molekyler av ungefär samma dimensioner som liknar ett baspar i DNA molekylen. När etidiumbromid binder till DNA glider den in mellan närliggande baspar och sträcker ut dubbelspiralen. Detta förklarar färgämnets mutagena effekt-de 'extra baserna' orsakar fel när DNA replikeras. Dessutom behövs kortvågigt UV-ljus (som också är mutagent) för att etidiumbromid skall fluoriscera och avslöja DNA. Av säkerhetsskäl och för att UV-ljus av denna våglängd kan orsaka mutationer i det DNA man skall studera, har flera forskare sökt alternativa metoder till att avslöja DNA.

Säkrare alternativ
Kristallviolett binder till DNA på ett likartat sätt som etidiumbromid och trots att det är mutagent anses det inte fullt så farligt som etidiumbromid. Eftersom man kan se DNA i vanligt dagsljus (man undviker skadligt UV-ljus) har vissa forskare, som skall använda ett fungerande DNA, förespråkat användning av kristallviolett.

Thiazin färgämnen
De vanligaste alternativen till etidiumbromid är metylenblått och dess oxidationsprodukter som Azur A, B och C, Toluidinblå O, Thionin och Brilliant kresylblått. Dessa färgämnen används individuellt eller i blandningar (ofta patenterade). Dess exakta verkningssätt är okänt, men man tror att de binder med jonbindningar till den negativt laddade utsidan av nukleinsyror (till de negativt laddade fosfatgrupperna) och kan därför användas både till att upptäcka DNA och enkelsträngat RNA.

Dessa färger är inte så känsliga som etidiumbromid och en del av dem färgar dessutom själva gelen. Av denna anledning behövs ofta en lång avfärgning av gelen innan DNA banden kan ses tydligt. Flera av färgerna bleks också mycket snabbt efter användning - metylenblått är en av de färgämnen som faller inom båda kategorierna och är därför trots sin stora popularitet i recept för skolor inte idealiska för färgning av DNA i en gel.

Alla thiazin färgämnen kan användas i 0,02-0,04 % vattenlösning och skall sättas till gelen efter att elektroforesen har körts. De kan också lösas i mild alkalisk lösning (t. ex. en elektroforesbuffert; med ett pH inte över 8). Avfärgning med utspädd ättiksyra eller med 0.2M natriumacetat buffert, pH 4.7, kan behövas om man använt alkaliska lösningar.

Åldern på färgämnet kan ha stor effekt på resultatet. Gammal metylenblåfärg innehåller nästa säkert en viss del av andra färgämnen (som Azur A och B) och dessa nedbrytningsprodukter kan avsevärt påverka infärgningsresultatet. Färglösningar förvaras bäst i glasflaskor (vissa färgerämnen färgar plast), som antingen lindas in i aluminiumfolie eller ställs i mörker.

Att färga DNA när det rör sig genom en gel
Nyligen har flera kommersiella produkter dykt upp på marknaden, som möjliggjort att man kan följa när DNA rör sig genom gelen. Firmorna avslöjar sällan sina produkter, men flera av dem innehåller nilblåsulfat (kallas också Nilblå A), ett färgämne som inte tidigare har noterats för färgning av DNA. Adkins och Burmeister (1996) ger en användbar information om detta färgämne, såväl som information hur man upptäcker andra färgämnen som kan färga DNA. Tidigare sålde en engelsk firma, Stratagene, en produkt som kallades Stratabloo, som var en blandning av nilblåsulfat och metylenblått.

Alla de färgsubstanser som används för att färga 'rörligt' DNA är katjoner - dvs de är positivt laddade i gelbufferten vid pH 8. De rör sig alltså i motsatt riktning genom gelen mot DNA och hakar fast vid DNA molekylerna när de möts. Den exakta mekanismen är okänd, men nilblåsulfat tror man interkalerar inom DNA dubbelspiralen.

För att få tillräckligt med färg i gelen, sätts färgämnet både till gelen och till bufferten som hälls ovanpå gelen. En betydligt lägre koncentration av färgämne (1-3 mg per ml) behövs vid denna metod, än vid färgning av gelen efter det att elektroforesen körts. Detta beror på att alltför mycket färg neutraliserar de negativt laddade DNA-fragmenten och därmed reduceras hastigheten och upplösningen. DNA kan till och med förhindras att röra sig alls. Det är därför en viktig kompromiss som måste göras mellan synlighet och upplösning. Vanligen får man bättre resultat om man färgar efter det att gelen har körts än under tiden den körs.

Torkning av geler
Det är också möjligt att torka en gel efter att färgämnet har tillförts och därmed koncentrera färgen i band som annars hade varit svåra att se. För att gelen skall torka jämnt är det bra om man placerar den blöta gelen på ett skrivpapper av god kvalitet och att därefter placera detta på flera lager av filtrerpapper. Fukten från gelen dras in i filtrerpapperen, medan skrivpappret hindrar färgen att alltför mycket dras ut ur gelen. Geler skall torkas vid rumstemperatur.

Säkerhet
Trots att flera av de färger som man kan se med normalt dagsljus anses relativt säkra, så har de inte studerats så ordentligt för långverkande toxiska effekter, som de fluoriscerande färgämnena. Tydligen interkalerar vissa av dessa synliga färger med DNA, som etidiumbromid och har alltså en potential för mutagenes och beroende på absorption och metabolism också en potential för carcinogenes. Liksom vid arbete med alla laboratorie-kemikalier skall man iaktta försiktighet vid handhavande av alla färgämnen, speciellt om de är i pulverform.

Vidare läsning

Metylenblått
Yung-Sharp, D. and Kumar, R. (1989) Protocols for the visualisation of DNA in electrophoretic gels by a safe and inexpensive alternative to ethidium bromide. Technique 1 (3) 183-187.
Flores, N. et al (1992) Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue. Biotechniques 13, 203-205.

Brilliant kresylblått
Santillán Torres, J. and Ponce-Noyoia, P. (1993) A novel stain for DNA in agarose gels Trends in Genetics 9 (2) 40.

Nilblåsulfat
Adkins, S. and Burmeister, M. (1996) Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: Applications for preparative gels and educational demonstrations Analytical Biochemistry 240 (1) 17-23.
http://www-personal.umich.edu/~steviema/blueDNA.html

Kristallviolett
Rand, N. (1996) Crystal violet can be used to visualise DNA bands during gel electrophoresis and to improve cloning efficiency Technical Tips Online
http://research.bmn.com/tto

This article is an extended version of one from 'Illuminating DNA' by Dean Madden.